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| HPLC法分析红豆杉中紫杉醇的含量 |
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作者： 转载自： 发布日期：2014-9-29
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紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxo1)是一种双萜类化合物，最初是由红豆杉树皮中分离出来的。临床细胞学研究表明，Taxol具有促进微管双聚体装配成微管，使微管稳定，从而阻碍细胞分裂，抑制肿瘤生长的作用，由于其独特的作用机理，显著的疗效，因此已用于转移性卵巢癌、乳腺癌等的治疗。Taxol的开发、研究和应用成为近年来肿瘤化疗研究中的热点之一。但是，紫杉醇在植物中的含量非常低(含量最高的红豆杉树皮也只有万分之几)[2]。本文采了SPE固相萃取技术和反相高效液相色谱法对福建省三明市沙溪人工种植的南方红豆杉1年生、2年生、4年生、5年生实生苗进行了紫杉醇含量测定，本文的实验结果对确认人工栽培红豆杉幼苗中紫杉醇的含量具有借鉴性，具有一定的社会价值和经济效益。
1 实验部分
1．1 试剂和仪器
Taxol纯品为SIGMA提供，乙腈、甲醇为色谱纯(Merck)水为超纯水，其他试剂均为分析纯。仪器为Waters Allaince 2695型高效液相色谱仪，Waters 2996二级管阵列检测器，色谱柱为waters Symmetry Cl8 3．9 X 150 mm。Cl8小柱(W aters)。
1．2 实验方法
1．2．1 色谱条件：流动相：甲醇+乙腈+水(22+36+4Z J，流量：1．0 mL／min，检测波长：230 nm检测，进样量：10 L，每次进样分析时间为10 min，室温操作。
1．2．2 标准溶液配制：精密称取一定量的紫杉醇对照品并用乙腈配制成浓度为10．2 mg／mL的标准品溶液，置冰箱低温保存，使用时用乙腈稀释配成下述绘制工作曲线的系列溶液。
1．3 样品提取
样品是在福建省三明市沙溪采集的人工栽培的不同年限生长的云南红豆杉实生苗，鲜品干燥粉碎后，取 末3 g于100 mL锥形瓶中，加95 9，6乙醇25mL浸泡24 h，超声处理2 h，离心(3000 rad／s、3min)过滤，残渣续以95 乙醇15 mL浸泡超声处理2次，每次3O min，离心(同上)取清液，合并滤液于100 mL烧杯中30℃以下风干，残渣用50甲醇5 mL溶解，离心，取上清液过0．45 m滤膜。
1．4 C18小柱固相萃取纯化
取18小柱，依次用6 mL乙酸乙酯，6 mL甲醇和10 mL水处理，进样前在小柱的上部必须保留约2 mL水。取1 mL样品处理液加入C 。小柱中，然后用10 mL水洗脱，弃去洗脱液，再用6 mL 50 9，6的甲醇溶液洗脱，弃去洗脱液，最后用5 mL 8O 9，5的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，为备用液。
2 结果与讨论
2．1 紫杉醇标准曲线的绘制及线性范围
用上述标准品溶液配制不同浓度的紫杉醇标准溶液，配成0．0、10．2、20．4、30．6、40．8、51．0 g／mL的系列溶液，按实验部分下的色谱条件操作，测得紫杉醇峰面积(A)与浓度值(C)回归方程为A一2×10 C+1576．5(R一0．9990)，表明紫杉醇在1O～ 6O~g／mL范围内具有良好的线性关系。
2．2 精密度试验
将紫杉醇标准溶液分别精密吸收1O L共5份，按标准曲线的测定条件测定紫杉醇的峰面积，试验结果得RSD=1．5%(n=5)。
2．3 加样回收率实验
精密称取三份样品各3 g，分别加入1O．2 g／mL的紫杉醇标准溶液1 mL，按样品提取步骤测定紫杉醇的含量，结果平均回收率为9O．2 9，6。
2．4 含量分析
取备用样液1O L注入HPLC色谱仪，等度洗脱，标准曲线外标法定量，计算Taxol含量。结果列于表1，谱图见图1，图2。
2．5 结果
以往文献报道，一般都是比较不同季节，不同地域的红豆杉中紫杉醇含量差异，而本文则选取了同一地区人工栽培的南方红豆杉中不同生长年限的树苗，其含量的差异从表i中可以看出，人工栽培红豆杉苗中均含有紫杉醇，其含量随着生长年限的延长而递减；5年生实生苗<4年生实生苗<2年生实生苗<4年生实生苗；其中，2年生中超级苗<实生苗<小苗。
2．6 讨论
2．6．I 样品的提取：以往文献多用甲醇作为提取溶剂，持续搅拌或搅拌2～4 h后放置过夜(i6～24h)的方法，而因甲醇有毒，所以牟德海、周治发等采用95％的乙醇溶液重复提取三次，实验结果表明，第三次提取的Taxol量为三次提取总量的1％～ 4 ，所以可认为提取完全。故本文采用95 的乙醇溶液作为溶剂，静置24 h后，超声2 h，提取3次的方法。
2．6．2 提取液纯化：文献中多以液一液萃取法、硅胶柱层析法或硅胶薄板层析法纯化提取液，但其溶剂用量大，回收率不高，而采用一次性固相萃取柱纯化，效果良好[3]。本文用标准溶液过C18小柱，进样量为1 mL，然后依次用10 mL的水、2 mL的5O％ 甲醇溶液连续洗脱5次、1．5 mL的8O％甲醇溶液连续洗脱5次，分别收集各次洗脱液，经色谱分析表明，使用C18(Waters)进行Taxol纯化时6mL的50％甲醇溶液在不洗脱紫杉醇的前提下最大限度地洗脱杂质，而5 mL 80 的甲醇溶液能将紫杉醇完全洗脱下来。
2．7 前景展望
为弥补天然资源的奇缺，国内外工作人员已开始了红豆杉栽培技术的研究，并取得了一定的成果。据资料表明此项研究在我国已开展了近10年，低海拔乃至温带地区均可做到人工扦插，加上密植技术的成功，使生长量大大提高，且紫杉醇含量也不低于野生植株。本文对从人工栽培红豆杉中提取紫杉醇的方向做出了有益的摸索，对解决紫杉醇来源问题进行了新的尝试，具有一定的借鉴意义。
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