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| 生物素标记试剂的合成方法改进及其在DNA合成中的应用 |
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作者： 转载自： 发布日期：2014-10-16
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摘要:以生物素，4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷，6-氨基-1-己醇，2-氰基乙氧基-双(N，N-二异丙基)亚磷酰胺等为原料，采用改进方法合成了生物素标记试剂———［1-N-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基］-2-氰乙氧基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(3)，总收率51．0%，其结构经1H NMR，13 C NMR，31 P NMR和MS确证。通过固相亚磷酰胺三酯法，应用3合成了一段含有十个碱基的5’-端生物素标记的寡核苷酸链，其结构经MS确证。
关键词:生物素;标记;固相亚磷酰胺三酯法;DNA合成
中图分类号:O626;O627．51文献标识码:A文章编号:1005-1511(2012)03-0331-03
近年来，核酸探针杂交技术在医疗科研和临床中被广泛采用，成为一项直接检查病原体、癌基因、遗传病基因突变等的重要手段。用于杂交的核酸探针必须先进行标记，可分为同位素标记和非同位素标记两大类。生物素标记的核酸探针属于非同位素标记，它是利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，分子杂交后用亲和素或链霉亲和素进行检测［1～4］。生物素标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简单方便。
Richard T Pon［5］设计合成了一种较为理想的生物素标记试剂———［1-N-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基］-2-氰乙氧基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(3)。3所含的6-氨基己基侧链显著增加了生物敏感性［6］，同时3中的二甲氧三苯基增加了稳定性，不仅有利于寡核苷酸链的合成与纯化，而且还可以在DNA合成仪上通过颜色变化检测连接效率。
为了推进3的应用，本文改进文献［5］方法，先将生物素与DMTrCl(4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷)反应制得1-N-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)生物素(1);1与6-氨基-1-己醇在氯甲酸乙酯中缩合制得1-N-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)生物素-6-氨基己醇(2);2与磷试剂2-氰乙氧基-双(N，N-二异丙基)亚磷酰胺(Ⅰ)［7］反应合成了3(Scheme1)，总收率51．0%，其结构经1H NMR，13 C NMR，31P NMR和MS确证。
改进方法将文献［5］路线由5步简化为3步，提高了生物素的转化率，同时避免了昂贵的硅试剂及TBAF(四丁基氟化铵)的使用。
为了验证改进方法的可行性，本文还采用固相亚磷胺三酯法，应用3合成了一段含有十个碱基的5’-端Biotin标记的寡核苷酸链Biotin-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A(记为Biotin-A10)［8～11］，其结构经MS确证。
1·实验部分
1．1仪器与试剂
Yanaco型显微熔点仪(温度计未校正);Brucker-600 MHz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标);Alltech HPLC 1500型液相色谱仪(HPLC);Bruker Daltonics ESI-Bio TOF-Q型高分辨质谱仪;ABI 394型DNA合成仪。
硅胶300目～400目，其余所用试剂均为分析纯;反应均在无水条件下进行，所用试剂都需作无水处理。
1．2合成
(1)1的合成在反应瓶中依次加入生物素2 g(8．2 mmol)的吡啶(40 mL)溶液，DMTrCl 8．32 g(24．6mmol)，Et3N 828 mg(8．2 mmol)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)250．4 mg(2．08 mmol)，搅拌下于70℃反应4 h。浓缩后用氯仿稀释，分液，有机相用5%柠檬酸钠溶液洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析［洗脱剂:V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=3∶97］纯化得橙红色固体1 3．36 g，收率75．0%;1H NMR(DMSO-d6)δ:1．43～1．64(m，6H，CH2)，2．16～2．19(m，4H，SCH2，COCH2)，3．11(m，1H，SCH)，3．72(s，6H，OCH3)，4．27～4．33(m，2H，NCH)，6．70(s，1H，NH)，6．84(d，4H，ArH)，7．22(m，9H，ArH)，11．94(s，1H，CO2H)。
(2)2的合成
在圆底烧瓶中加入1 1．65 g(3．02 mmol)的THF(16 mL)溶液和Et3N 306 mg(3．02 mmol)，搅拌下于0℃缓慢滴加氯甲酸乙酯654 mg(6．04mmol)，滴毕，反应1 h;冷却至－20℃，加入6-氨基-1-己醇608 mg(6．04 mmol)，反应过夜。加水稀释后用氯仿(3×100 mL)萃取，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析［洗脱剂:V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶20］纯化得白色固体2 1．56 g，收率79．3%;1H NMRδ:1．24～1．70(m，14H，CH2)，2．15(t，2H，NCH2)，2．25～2．60(m，2H，COCH2)，3．08～3．23(m，3H，CHS)，3．60(t，2H，OCH2)，3．80(s，6H，OCH3)，4．36(m，2H，NCH)，5．10(s，1H，NH)，5．63(s，1H，NH)，6．81(d，4H，ArH)，7．22(m，9H，ArH)。
(3)3的合成
在反应瓶中依次加入2 645 mg(1 mmol)的无水乙腈(10 mL)溶液，四氮唑140 mg(2 mmol)，DIPA(N，N-二异丙胺)242．3 mg(2．4 mmol)和Ⅰ600 mg(2 mmol)，搅拌下于室温反应2 h。用二氯甲烷(200 mL)稀释，分液，有机相依次用5%碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析［洗脱剂:V(Et3N)∶V(氯仿)=1∶19］纯化得白色固体3 724 mg，收率85．7%，m．p．148℃～150℃;1H NMRδ:1．21(m，12H，CH3)，1．24～1．90(m，14H，CH2)，2．17(t，2H，NCH2)，2．22～2．60(m，2H，COCH2)，2．65(t，2H，CH2CN)，3．08～3．30(m，3H，CHS)，3．53～3．78(m，4H，OCH2)，3．80(s，6H，OCH3)，4．35(m，2H，CHN)，5．13(s，1H，NH)，5．61(s，1H，NH)，6．81(d，4H，ArH)，7．22(m，9H，ArH);13C NMRδ:11．44，24．55，24．60，24．66，25．23，25．61，26．63，29．50，39．31，42．96，43．01，46．20，54．41，55．23，58．20，59．66，65．40，72．74，112．79，117．77，126．86，127．48，129．74，131．30，135．83，135．91，143．86，158．39，161．81，172．92;31P NMRδ:147．81(s);ESI-MS m/z:868{［M+Na］+}。
1．3 3在合成DNA中的应用
在反应瓶中加入0．1 mol·L－13的乙腈溶液，置DNA合成仪上，在一段含10个A碱基的寡核苷酸链(A10)的5’-端连接3;其N-DMT(N-上的4，4’-二甲基三苯基甲基保护基)经5%三氯乙酸/二氯甲烷脱去后于55℃氨解10 h。经反相HPLC纯化(条件见表1)得目标序列Biotin-A10;ESI-MS m/z:3 474。
2·结果与讨论
本文以文献［5］工作为基础，改进合成3的方法。由1合成2采用混合酸酐法，利用氨基与羟基反应活性的差异一步生成酰胺，避免了羟基的保护与脱保护，简化了反应步骤。
由2合成3选用Ⅰ为磷试剂比2-氰基乙氧基-N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺(Ⅱ)［5］的稳定性更好、后处理方便、且原料转化率高，3总收率达51．0%。此外，Ⅰ可大量合成，相对于昂贵的Ⅱ成本大大降低，有利于工业化生产。
本文将3应用于合成DNA，成功地制得Bio-tin-A10，充分显示了3在合成DNA中的广阔应用前景。
为了提高生物素的转化率，DMTrCl，6-氨基-1-己醇，Ⅰ均要过量;因为Ⅰ易被氧化，由2合成3应在氮气保护下进行。
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